作者：陳建林、吳莉紅、吳良燕、梁思群、戴娟、沈月單位：柳州市柳鐵中心醫(yī)院案例發(fā)生比較典型，為了避免發(fā)生類似的問題，梳理原因分析過程并整理實驗驗證資料，與大家進(jìn)行分享。
9月21日下午16:00接班時，值班老師稱當(dāng)日新冠核酸RT-PCR擴(kuò)增失敗致使檢驗報告全部未發(fā)，正在準(zhǔn)備對標(biāo)本重新復(fù)查。實驗室使用的新型冠狀病毒（2019-nCoV）試劑盒檢測ORF1ab、N基因和RNase P基因。
當(dāng)天出現(xiàn)異常結(jié)果如下：第2-7列樣本和A7孔位弱陽性對照擴(kuò)增曲線未出（正常陰性樣本和弱陽性對照內(nèi)參基因都應(yīng)有擴(kuò)增，弱陽性對照ORF1ab和N 基因也應(yīng)有擴(kuò)增）（圖1），第1列樣本內(nèi)參基因正常檢出，E8孔位弱陽性對照正常檢出(圖2)。
由于時間緊迫，筆者立即參與到原因分析中來。經(jīng)查當(dāng)日核酸提取儀、熒光定量PCR儀都運(yùn)作正常且前一天實驗結(jié)果未出現(xiàn)此種情形，初步排除了儀器的原因。由于存在少部分樣本有擴(kuò)增曲線而大部分樣本擴(kuò)增失敗，（因提取試劑1塊96深孔板同時提取16份樣本，上機(jī)檢測使用的8連管體系放置在相鄰的兩列）從擴(kuò)增失敗樣本的分布來看可初步排除提取試劑的質(zhì)量問題。據(jù)檢測人員回憶，本次檢測所使用的擴(kuò)增體系存在混用情況，即有擴(kuò)增曲線的體系為當(dāng)天分裝，不出結(jié)果的體系為前一天分裝。由于前一天分裝體系弱陽性對照不出（A7），第一直覺是前一天分裝的擴(kuò)增體系出現(xiàn)問題。但是，查核前一天分裝體系的批號和保存狀態(tài)與當(dāng)天一致，并未發(fā)現(xiàn)異常。由于質(zhì)控失控，所有標(biāo)本需要重新復(fù)查。雖然初步排除了提取試劑的質(zhì)量問題，為了萬無一失，實驗人員再次重提核酸進(jìn)行檢測。鑒于擴(kuò)增體系分裝的疑點較大，故換人重新分裝擴(kuò)增體系（批號未變）。檢測后奇怪的事情再次出現(xiàn)，見下圖。第1-5列樣本(使用當(dāng)天第一次分裝體系)內(nèi)參基因均有曲線（圖3），第6-7列樣本（用當(dāng)天第二次分裝體系）包括弱陽性對照都未有陽性擴(kuò)增曲線（圖4），實驗再次失敗。難道是同一批號的擴(kuò)增試劑中有部分存在質(zhì)量問題？（在此之前出現(xiàn)過一次擴(kuò)增試劑酶混合液量不足的案例）再次核對試劑的批號、保存狀態(tài)以及試劑批號更換性能驗證結(jié)果均未見異常，綜合判斷此種情形存在的概率非常低。這時再次將疑點轉(zhuǎn)移到試劑的分裝上來。為了進(jìn)一步明確問題所在，筆者對擴(kuò)增體系進(jìn)行了第三次分裝，同時為了排除一切干擾因素，本次分裝棄用之前的方法（體系先混在小容器中，再用排槍快速分裝），改用20ul單通道加樣槍在試劑盒原管中混合體系進(jìn)行分裝，同時設(shè)計對照試驗明確原因所在。擴(kuò)增結(jié)果詳見圖5-圖8。本次試驗第1-4列和第6列為筆者分裝體系（圖5，圖6），第5列為當(dāng)天第二次分裝體系（圖8），其中第1列和第5列對應(yīng)孔位所加模板（重新抽提）一致（圖7，圖8），B6，D6，F(xiàn)6為同一批號不同批次分裝試劑盒的弱陽性對照（圖5），分別來自筆者分裝試劑盒、當(dāng)天第二次分裝試劑盒、已檢測為弱陽性的試劑盒。從上述結(jié)果可以看出，不同試劑盒中的弱陽性對照均有擴(kuò)增，證明筆者分裝試劑盒無質(zhì)量問題，當(dāng)天第二次分裝試劑盒的弱陽性對照也無質(zhì)量問題，結(jié)合圖4擴(kuò)增結(jié)果，圖7、圖8相同模板第1列有擴(kuò)增而第5列無擴(kuò)增，可以判定當(dāng)天第二次分裝的體系也存在問題。綜上分析，同樣的試劑盒，分裝方法不同導(dǎo)致實驗失敗，大家將問題一致指向了分裝時所使用的承裝體系的透明小蓋。難道是因為透明小蓋上存在某種抑制物，抑制了PCR反應(yīng)？圖9 使用排槍給提取試劑預(yù)加蛋白酶K的透明小蓋（容器） 圖10使用排槍分裝體系時混合擴(kuò)增體系各成份的透明小蓋（容器）由此，筆者逐一詢問了前一天值班人員和當(dāng)天值班人員提取試劑和擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備的操作細(xì)節(jié)，發(fā)現(xiàn)前一天值班人員分裝體系時誤用了盛裝蛋白酶K的專用透明小蓋來盛裝擴(kuò)增體系，當(dāng)天值班人員在進(jìn)行復(fù)查時誤用承裝擴(kuò)增體系的透明小蓋來盛裝蛋白酶K準(zhǔn)備提取試劑。此時，失控原因終于有了眉頭，也能很好的解釋圖1、圖4和圖8為什么擴(kuò)增失敗，尤其是當(dāng)天第二次體系分裝時雖然規(guī)范操作，但分裝人員并不知情透明小蓋已被蛋白酶K污染，以致最終實驗失敗。幸運(yùn)的是當(dāng)天第一次體系分裝時專用透明小蓋尚未被污染，分裝的體系得以幸免。思路逐漸清晰，為了初步驗證上述判斷，筆者對已分裝體系人為的進(jìn)行了微量的蛋白酶K污染，看抑制效應(yīng)能否再現(xiàn)，結(jié)果見圖11、圖12。為了進(jìn)一步明確蛋白酶K的抑制效應(yīng)和抑制濃度，筆者對蛋白酶K（原液濃度30mg/ml）進(jìn)行95℃，10min滅活，同時對蛋白酶K的終濃度進(jìn)行了梯度稀釋，實驗設(shè)計如表1。對上述不同干預(yù)濃度進(jìn)行3個復(fù)孔擴(kuò)增，模板為弱陽性對照（5ul/孔），擴(kuò)增結(jié)果如下表2和圖13-圖20。
表2 不同干預(yù)濃度樣本的擴(kuò)增結(jié)果（Ct值）
從上述結(jié)果我們可以看出，滅活后的蛋白酶K已不存在抑制效應(yīng)(圖17)，進(jìn)一步印證了實驗失敗的最重要的原因-蛋白酶K殘留。從擴(kuò)增曲線來看，終濃度5.689 mg/ml蛋白酶K可以完全抑制擴(kuò)增反應(yīng)(圖13)。雖然低濃度的蛋白酶存在時（如低于0.5689mg/ml），從Ct值來看目的基因和內(nèi)參基因基本不受影響(表2，圖.18)，但從擴(kuò)增曲線對比來看，ORF1ab基因在終濃度0.5689mg/ml蛋白酶K存在時仍有顯著的抑制效應(yīng)，只是尚未能完全抑制擴(kuò)增反應(yīng)，N基因在終濃度0.005689mg/ml蛋白酶K存在時，擴(kuò)增曲線 “指數(shù)期”較為平坦熒光強(qiáng)度較低，仍存在些許抑制效應(yīng)，只是效應(yīng)較?。▓D14、圖15、圖16、圖17）。那么問題又來了，蛋白酶K到底是如何影響RT-PCR反應(yīng)的呢？蛋白酶K（EC3.4.21.14）由一條肽鏈組成，包含277個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為28.9kDa屬絲氨酸蛋白酶類，蛋白酶K家族包含了各種真菌、酵母及革蘭氏陰性細(xì)菌分泌的細(xì)胞內(nèi)肽酶。1974年，Wolfgang Ebeling等利用沉淀、離子交換層析和凝聚層析等方法在林伯氏白色念球菌的培養(yǎng)基中分離純化出蛋白酶K。因能合成該種蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Keratin)為唯一碳氮源的環(huán)境中生長，即能夠消化角蛋白，因此被命名為蛋白酶K。
與其它的蛋白酶相比較，蛋白酶K具有高活力和高穩(wěn)定性，其酶活性不會被尿素、SDS和EDTA等變性劑抑制，且在高溫、高鹽或較高的pH等條件下，蛋白酶K仍能保持較高活性。因該酶在較廣的pH范圍(4～12.5)內(nèi)及高溫(50～70℃)均有活性，在提取DNA和RNA的緩沖液中具有很高的活性，可用于質(zhì)?；蚧蚪MDNA、RNA的分離，是DNA提取的關(guān)鍵試劑。在病毒核酸檢測中，蛋白酶K是病毒采樣液中的重要組分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外殼蛋白并使其失活，這樣在運(yùn)輸和檢測階段更安全；另外，蛋白酶K還可以降解RNA酶，防止病毒RNA的降解，有利于核酸檢測。
同時也查看了擴(kuò)增試劑盒的反應(yīng)程序：表3 項目的擴(kuò)增反應(yīng)的設(shè)置程序從擴(kuò)增程序中我們不難發(fā)現(xiàn)，在逆轉(zhuǎn)錄階段，溫度設(shè)置為50℃且持續(xù)10min，而此階段正好為蛋白酶K發(fā)揮效應(yīng)提供了最適溫度。由此判斷，擴(kuò)增體系中的逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA 聚合酶均在此階段遭受了不同程度的降解，從而出現(xiàn)了案例中出現(xiàn)的抑制效應(yīng)。
通過此失控案例，筆者對日常質(zhì)量控制和實驗室管理進(jìn)行了總結(jié)和反思：
1、日常工作中要謹(jǐn)防PCR質(zhì)控失控
PCR日常工作中，由于質(zhì)控樣品和標(biāo)本同時檢測同時出結(jié)果，一旦出現(xiàn)失控或結(jié)果異常，原因分析和復(fù)查將非常的耗時耗力，復(fù)查的平均時長少則持續(xù)80-90min，多則需要4-5h，如果中間再次出差錯，將會造成嚴(yán)重的時間浪費(fèi)。
本次失控原因查找過程中，通過觀察反應(yīng)曲線，雖然很快定位是前一天分裝的體系出現(xiàn)問題，但未能明確是體系分裝（體系混合盛裝）的干擾，在后續(xù)復(fù)查中再次出現(xiàn)嚴(yán)重的操作污染，導(dǎo)致后續(xù)分裝的體系擴(kuò)增失敗、附帶弱陽性對照不出，造成了所有標(biāo)本二次復(fù)查的窘境。不僅造成試劑的損耗和時間的浪費(fèi)，差一點影響到失控原因的判斷，所謂教訓(xùn)慘痛。因此，在PCR過程中，操作人員需要細(xì)心、細(xì)心、再細(xì)心，同時也提醒我們對日常的培訓(xùn)要深入細(xì)節(jié)，避免“細(xì)節(jié)性差錯”重復(fù)發(fā)生。
3、失控后應(yīng)學(xué)會“追根究底”
在檢驗過程失控后，我們要學(xué)會去深挖失控背后的根本原因，不僅要知其然還要知其所以然。本案例中，通過查閱說明書，實驗驗證和回顧性分析，推斷出蛋白酶K抑制擴(kuò)增反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，最終明確了蛋白酶K抑制擴(kuò)增反應(yīng)的機(jī)制。雖然過程比較曲折，但為后續(xù)的工作積累了寶貴的經(jīng)驗。讓“抑制物”這一概念有了非常深的認(rèn)識，這將對后續(xù)的工作將起到非常深刻的警示作用。
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