學(xué)術(shù)分享

集高靈敏度、快速、高特異性于一身的qPCR，是分子診斷學(xué)最常用的一種方法；然而，大家常常會(huì)被它的異常曲線所困擾。比如，某個(gè)通道所有陰性樣本的擴(kuò)增曲線都向下傾（如下圖）。今天，伯杰技術(shù)就與您分享導(dǎo)致這種“怪異曲線”的原因及解決方案。

原因分析

這種怪異曲線下傾的根本原因是qPCR儀矯正過度導(dǎo)致的，熒光的發(fā)射光譜是一個(gè)拋物線，常見的熒光物質(zhì)FAM、 VIC、 ROX的發(fā)射光譜之間存在交叉（如下圖），qPCR 儀通過計(jì)算減去因交叉誤讀的信號(hào)，常見的計(jì)算方法是：A 通道計(jì)算得到的信號(hào)（FA）= A通道檢測的信號(hào)– B通道檢測的信號(hào)*K，這個(gè)的K是機(jī)器預(yù)設(shè)的固定參數(shù)；有時(shí)，B通道串到A通道的實(shí)際信號(hào)的比值要小于固定參數(shù)K，設(shè)備在計(jì)算時(shí)就導(dǎo)致了A 通道擴(kuò)增曲線向下傾斜的情況。

舉個(gè)例子，在FAM通道檢測的信號(hào)中，假設(shè)機(jī)器預(yù)設(shè)ROX通道串到FAM 通道的K=20%，但是實(shí)際上串到FAM 通道的ROX信號(hào)只占ROX通道檢測信號(hào)的10%；而機(jī)器在計(jì)算時(shí)，只會(huì)按照預(yù)設(shè)的固定參數(shù)K=20%進(jìn)行計(jì)算，即，F(xiàn)AM通道每次都會(huì)多減去10% ROX通道的檢測信號(hào)。隨著擴(kuò)增ROX通道信號(hào)越來越大，F(xiàn)AM通道多減去的信號(hào)也越來越大，若此時(shí)FAM 通道是陰性樣本，就導(dǎo)致擴(kuò)增曲線傾斜的更嚴(yán)重。

解決方法

2、點(diǎn)擊”Plate” → “Advanced Setup”，關(guān)閉其他通道，如下圖所示：

3、點(diǎn)擊”Results”，回到結(jié)果分析界面，然后，點(diǎn)擊“Analyze”重新分析即可，如下圖所示：

看，重新分析后的曲線，是不是清爽許多？回到了原來那熟悉的樣子

（本文以ABI Q5儀器為例，其他機(jī)型如遇該問題，也可使用該方法調(diào)整、分析）